Caracterização e genômica comparativa de isolados de Leishmania (Leishmania) infantum com diferentes perfis de resistência

Abstract

RESUMO

Leishmania (Leishmania) infantum é o agente etiológico da leishmaniose visceral (LV) nas Américas, caracterizada por manifestações clínicas sistêmicas e elevada letalidade quando não tratada. A quimioterapia constitui a principal estratégia de controle da LV, sendo o antimoniato de meglumina (Glucantime®) e a Anfotericina B os fármacos de primeira e segunda escolha. A Miltefosina, embora ainda não aprovada para o tratamento da LV no país, tem sido investigada como alternativa terapêutica. Entretanto, o surgimento de isolados resistentes a esses medicamentos representa uma preocupação crescente, especialmente em regiões endêmicas. A resistência a drogas em Leishmania é um fenômeno multifatorial, fortemente associado à elevada plasticidade genômica característica desse gênero de parasitos. Estudos prévios do nosso grupo de pesquisa, tem caracterizado isolados clínicos de L. (L.) infantum com distintos perfis de sensibilidade frente aos medicamentos utilizados no tratamento de LV. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização genômica de dois isolados clínicos de L. (L.) infantum provenientes de pacientes do estado do Maranhão, classificados como resistente ou sensível ao Glucantime®

, à Anfotericina B e à Miltefosina. Por meio de uma abordagem de genômica comparativa, ferramentas de bioinformática foram utilizadas para identificar alterações cromossômicas, CNVs (variações no número de cópias, do inglês Copy Number Variations), SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único, do inglês Single Nucleotide Polymorphisms) e deleções. O alinhamento ao genoma de referência foi realizado com o BWA, o processamento do alinhamento com SAMtools e Picard, a chamada de variantes com o PAINT, e as análises de cobertura, somia cromossômica e visualizações gráficas no ambiente R. Os resultados evidenciaram um cariótipo predominantemente dissômico em ambos os isolados, com aneuploidias pontuais, incluindo tetrassomias e uma discreta amplificação no cromossomo 20 do isolado M03, confirmando o mosaicismo aneuploide característico de Leishmania. Observou-se ainda uma distribuição heterogênea de SNPs ao longo dos 36 cromossomos, com variações quantitativas importantes ao comparar os dois isolados, demonstrando que existem diferenças polimórficas a serem melhor investigadas. Adicionalmente, no isolado resistente M03 foi identificada a deleção completa do lócus MSL (Lócus de Sensibilidade a Miltefosina, do inglês Miltefosine Sensitivity Locus), envolvendo a perda de seus quatro genes, alteração associada à resistência à Miltefosina. Em conclusão, os resultados reforçam o papel da plasticidade genômica como mecanismo adaptativo em L. (L.) infantum e sugerem que a combinação de aneuploidias e o acúmulo de variantes genéticas específicas pode contribuir para os diferentes perfis de suscetibilidade aos fármacos observados. Este estudo amplia a compreensão sobre os mecanismos moleculares de resistência em isolados clínicos circulantes no Brasil e pode subsidiar o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o tratamento e controle da LV. ABSTRACT

Leishmania (Leishmania) infantum is the etiological agent of visceral leishmaniasis (VL) in the Americas, a disease characterized by systemic clinical manifestations and high lethality when untreated. Chemotherapy is the main strategy for VL control, with meglumine antimoniate (Glucantime®) and Amphotericin B being the first- and second-line drugs, respectively. Miltefosine, although not yet approved for VL treatment in Brazil, has been investigated as an alternative therapeutic option. However, the emergence of isolates resistant to these drugs represents a growing concern, especially in endemic regions. Drug resistance in Leishmania is a multifactorial phenomenon, strongly associated with the high genomic plasticity that characterizes this genus. Previous studies by our research group have characterized clinical isolates of L. (L.) infantum with distinct susceptibility profiles to drugs used in VL treatment. Thus, the aim of this study was to perform the genomic characterization of two clinical isolates of L. (L.) infantum obtained from patients in the state of Maranhão, classified as resistant or sensitive to Glucantime®, Amphotericin B, and Miltefosine. Using a comparative genomics approach, bioinformatics tools were applied to identify chromosomal alterations, CNVs (Copy Number Variations), SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), and deletions. Alignment to the reference genome was performed with BWA, alignment processing with SAMtools and Picard, variant calling with PAINT, and coverage analyses, chromosomal somy estimation, and graphical visualizations were carried out in the R environment. The results revealed a predominantly disomic karyotype in both isolates, with punctual aneuploidies, including tetrasomies and a subtle amplification of chromosome 20 in isolate M03, confirming the aneuploid mosaicism characteristic of Leishmania. A heterogeneous distribution of SNPs was also observed along the 36 chromosomes, with important quantitative variations when comparing the two isolates, demonstrating the existence of polymorphic differences that warrant further investigation. Additionally, in the resistant isolate M03, a complete deletion of the MSL locus (“Miltefosine Sensitivity Locus”) was identified, involving the loss of its four constituent genes, a genomic alteration associated with Miltefosine resistance. In conclusion, these results reinforce the role of genomic plasticity as an adaptive mechanism in L. (L.) infantum and suggest that the combination of aneuploidies and the accumulation of specific genetic variants may contribute to the distinct drug susceptibility profiles observed. This study expands the understanding of the molecular mechanisms of resistance in clinical isolates circulating in Brazil and may support the development of more effective strategies for the treatment and control of VL.