AVALIAÇÃO DA CITOTÓXICIDADE DOS VENENOS DE Tityus bahiensis e Tityus serrulatus E SEUS EFEITOS SOBRE MACRÓFAGOS INFECTADOS COM BACTÉRIAS

Abstract

O escorpionismo é um problema que afeta vários países, em áreas de clima tropical e subtropical, principalmente nos centros urbanos. No Brasil, os escorpiões que geralmente são responsáveis pelos acidentes graves pertencem ao gênero Tityus, destaca-se T. serrulatus, com registros de óbitos e ampla distribuição no território nacional. De acordo com a literatura o vTs tem a capacidade de induzir a liberação de vários mediadores inflamatórios tais como IL- 1α, interferon-γ (INF-γ), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator de necrose tumoral - α (TNF-α), IL-10 e prostaglandinas E2. Estudos demonstram ainda que os peptídeos TsAP-1 e TsAP-2 isolados do veneno apresentam atividade microbicida. Com base nestas informações, o presente estudo visou avaliar a citotoxicidade do vTb e vTs em diferentes concentrações, em linhagem de células humanas e murinas, investigando também a ação do veneno puro na ativação de macrófagos, infectados com as bactérias Escherichia coli e Enteroccocus faecalis presentes na flora normal de camundongos, além de uma bactéria gram-positiva resistente a meticilina, sendo esta Staphyloccocus aureus. Sendo assim investigamos a toxicidade in vitro dos vTb e vTs nas concentrações de 1,0 μg/mL, 1 μg/mL e 10 μg/mL, incubados por 24 horas em estufa de CO2 5% a 37°C, em macrófagos RAW 264.7 e células mononucleares do sangue periférico. As células foram cultivadas em placa de 96 poços a partir de uma suspensão celular de 2x106/mL, a placa foi incubada por 1h em estufa de CO2 a 5% a 37ºC para posterior estimulação com 10μL das suspensões dos vTb e vTs nas 1,0 μg/mL, 1 μg/mL e 10 μg/mL. Após o tempo de incubação, os macrófagos foram co-cultivados por 1h com 2x107/mL de bactérias, obtendo-se uma multiplicidade de infecção de 1:10. Em seguida, os macrófagos foram lisados para liberação das bactérias fagocitadas e por meio do ensaio de MTT verificou-se a viabilidade celular das bactérias para obtenção da porcentagem de atividade microbicida. Além disso, foi realizada a dosagem de óxido nítrico do sobrenadante de culturas de macrófagos estimuladas por 2 hs com Lipopolissacarídeo e incubados em seguida com veneno em estufa por 48 hs. Os resultados mostraram que não houve efeito citotóxico do vTb para linhagens murina, porém, quando analisado o vTs nessas linhagens percebeu-se efeito citotóxico. Os vTb e vTs não demostraram atividades citotóxica para linhagem humana. Os ensaios com E. coli, evidenciaram que a cepa tratada com diferentes concentrações dos venenos, obtiveram aumento significativo na atividade citotóxica em relação aos grupos sem estimulo (Ctrl) e estimulado com LPS. Em relação a bactéria E. faecalis, o vTb obteve menor atividade citotóxica em comparação ao controle, no entanto o vTs demostrou o contrário quando comparado ao controle. O efeito citotóxico em S. aureus resistente a meticilina apresentou-se significativo na concentração 0,1 μg/mL de vTb em comparação ao controle. Em relação a produção de óxido nítrico, foi observado relevante aumento no grupo estimulado com 0,1 μg/mL do vTb e 10μg/mL do vTs. Dessa forma podemos concluir que tanto o vTb bem como o vTs foi capaz de potencializar a atividade microbicida de macrófagos, bem como estimular a produção de óxido nítrico na maior concentração testada. Além disso, resultados mostraram que os vTb e vTs, são capazes de aumentar a produção citocinas pró-inflamatorias como IL-6 e TNF-α, com destaque nas concentrações de 0,1μg/mL de vTb.