Cristalização da lectina de Dioclea violacea complexada com o antibiótico gentamicina

Abstract

RESUMO Com propriedades específicas de se ligarem de forma reversível a carboidratos, as lectinas são proteínas de origem não-imunológica que são amplamente encontradas na maioria dos seres vivos e apresentam diversas aplicações biotecnológicas. Visando isso, a cristalografia é uma área de estudo crucial para a elucidação da estrutura tridimensional e compreensão dos prováveis papéis biológicos que as mesmas podem exercer. O objetivo do presente estudo foi cristalizar e analisar a interação da lectina das sementes de Dioclea violacea (DVL) complexada com o antibiótico aminoglicosídeo, gentamicina, por meio da técnica de cristalografia. A DVL foi purificada por um único passo cromatográfico de afinidade, o extrato proteico foi aplicada em uma coluna sephadex G-75, a fração não retida foi removida com NaCl 0,15 M e a fração retida eluída com glicose 0,2 M. A cristalização ocorreu sobre o método de difusão de vapor por gota suspensa, utilizando os “kits” de cristalização Crystal Screen 1, 2, 3 e 4 (Jena Bioscience). Os resultados da purificação demostraram a especificidade da DVL por glicose/manose, com o perfil eletroforético exibindo três bandas correspondentes à cadeia α (25,5 kDa), β (14 kDa) e γ (12 kDa). Os cristais de DVL complexado com a gentamicina cresceram após três semanas sob duas condições do kit JBScreen II. O cristal em formato de cubo, cresceu na condição Nº 40, contendo 10% de PEG 8000, 8% de Etilenoglicol, 100 mM de HEPES com pH 7,5. Os cristais em formato de agulhas foram obtidos na condição Nº 27, que continha 20% de PEG 4000, 10% de 2-propanol e 100 mM de HEPES com pH 7,5. A obtenção dos cristais de DVL complexados com gentamicina, é uma forte evidência da interação estabelecida entre a proteína e o antibiótico, apresentando-se com um possível potencial modulador que pode aumentar a eficácia do fármaco.___ABSTRACT With specific properties of reversibly binding to carbohydrates, lectins are non-immunological proteins that are widely found in most living things and have a variety of biotechnological applications. In view of this, crystallography is a crucial area of study for the elucidation of the three-dimensional structure and understanding of the probable biological roles they may play. The aim of this study was to crystallize and analyze the interaction of lectin from Dioclea violacea (DVL) seeds complexed with the aminoglycoside antibiotic gentamicin by crystallography technique. DVL was purified by a single affinity chromatographic step, the protein extract was applied to a sephadex G-75 column, the non-retained fraction was removed with 0.15 M NaCl and the retained fraction eluted with 0.2 M glucose. Crystallization occurred over the suspended drop vapor diffusion method using the Crystal Screen 1, 2, 3 and 4 crystallization kits (Jena Bioscience). Purification results demonstrated the specificity of glucose / mannose DVL, with the electrophoretic profile showing three bands corresponding to the α (25.5 kDa), β (14 kDa) and γ (12 kDa) chains. Gentamicin-complexed DVL crystals grew after three weeks under two conditions of the JBScreen II kit. The cube-shaped crystal grew in condition No. 40 containing 10% PEG 8000, 8% of Ethylene Glycol, 100 mM HEPES pH 7.5. Needle-shaped crystals were obtained under condition No. 27, which contained 20% PEG 4000, 10% 2-propanol and 100 mM HEPES at pH 7.5. Obtaining gentamicin-complexed DVL crystals is strong evidence of the established interaction between the protein and the antibiotic, presenting itself as a possible potential modulator that may increase drug efficacy.