Purificação e caracterização físico – química de uma lectina ligante à manose das sementes de Parkia pendula (WILLD.) benth. ex walp.

Abstract

RESUMO As lectinas são um grupo de proteínas que apresentam como principal característica a capacidade de estabelecerem ligação específica e reversível a carboidratos, podendo aglutinar eritrócitos. Essa propriedade faz delas uma importante ferramenta biotecnológica, pois são capazes de decifrar o glicocódigo presente nas superfícies celulares. As proteínas com especificidade para carboidratos são encontradas de forma ubíqua na natureza, mas com teor variável entre os organismos. As sementes de leguminosas, família Fabaceae, apresentam abundância dessas proteínas e atualmente são as mais bem estudadas. Das três subfamílias de Fabaceae, Papilionoideae é a que possui um maior número de lectinas isoladas e as mais bem caracterizadas, quando comparadas com espécies das subfamílias Caesalpinoideae e Mimosoideae. Nesta última, encontra-se o gênero Parkia, cujas lectinas já isoladas de algumas espécies apresentam importantes papéis biológicos. Neste trabalho, o objetivo foi purificar e caracterizar em relação a alguns aspectos físico-químicos uma lectina a partir das sementes de Parkia pendula. O extrato bruto obtido a partir da homogeneização da farinha das sementes em tampão Tris – HCl 25 mM pH 7,6 com NaCl 150 mM foi aplicado em coluna de cromatografia de afinidade com matriz agarose-manose. A atividade hemaglutinante foi testada em eritrócitos de coelho sem tratamento e tratados com enzimas proteolíticas. O ensaio de inibição dessa atividade foi realizado com carboidratos e glicoproteínas. Para determinar a influência do pH e da temperatura sobre a atividade, o ensaio de hemaglutinação foi realizado em tampões com diferentes valores de pH e após aquecimento gradual da amostra. A lectina foi purificada por etapa única de cromatografia de afinidade em coluna agarose-manose. Por análise de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio, a proteína apresentou uma banda única com massa molecular aparente de 45 KDa, semelhante a outras lectinas do mesmo gênero. O teste de hemaglutinação obteve um melhor resultado em eritrócitos tratados com a enzima tripsina, esse efeito foi inibido por manose, glicose e seus derivados, especialmente por α-metil-D-manopiranosídeo. Os testes de hemaglutinação sob variação das condições de pH e temperatura demonstraram que a lectina é estável em uma faixa levemente ácida à neutra, entre 5 e 7, e tem sua atividade hemaglutinante inalterada até aos 50 ºC. Os resultados alcançados neste trabalho agregam informações físico-químicas à lectina de P. pendula e ainda ampliam os estudos relacionados a lectinas da subfamília Mimosoideae. ____ ABSTRACT Lectins are a group of proteins that have as their main characteristic the ability to establish specific and reversible binding to carbohydrates, and can agglutinate erythrocytes. This property makes them an important biotechnological tool, because they are able to decipher the glycocode present on cell surfaces. Carbohydrate-specific proteins are ubiquitously found in nature, but their content varies among organisms. The seeds of legumes, family Fabaceae, have an abundance of these proteins and are currently the best studied. Of the three subfamilies of Fabaceae, Papilionoideae is the one with the largest number of isolated lectins and the best characterized, when compared to species of the subfamilies Caesalpinoideae and Mimosoideae. In the latter, we find the Parkia genus, whose lectins already isolated from some species have important biological roles. In this work, the objective was to purify and characterize in relation to some physicochemical aspects a lectin from Parkia pendula seeds. The crude extract obtained from the homogenization of the seed flour in 25 mM Tris - HCl buffer pH 7.6 with 0.15 M NaCl was applied to an affinity chromatography column with an agarose-mannose matrix. The hemagglutinating activity was tested on untreated and proteolytic enzyme-treated rabbit erythrocytes. The inhibition assay of this activity was performed with carbohydrates and glycoproteins. To determine the influence of pH and temperature on the activity, the hemagglutination assay was performed in buffers with different pH values and after gradual heating of the sample. Lectin was purified by single-step agarose-mannose column affinity chromatography. By polyacrylamide gel electrophoresis analysis in the presence of sodium dodecyl sulfate, the protein showed a single band with apparent molecular mass of 45 KDa, similar to other lectins of the same genus. The hemagglutination test obtained a better result in erythrocytes treated with the enzyme trypsin, this effect was inhibited by mannose, glucose and their derivatives, especially by α-methyl-D-mannopyranoside. Hemagglutination tests under varying pH and temperature conditions demonstrated that the lectin is stable in a slightly acidic to neutral range, between 5 and 7, and has its hemagglutinating activity unchanged up to 50 ºC. The results achieved in this work add physicochemical information to the lectin of P. pendula and also extend the studies related to lectins of the Mimosoideae subfamily.