Análise genômica global de carcinomas penianos de pacientes do estado do Maranhão por ARRAY-CGH (Comparative Genomic Hybridization)

Abstract

RESUMO: O câncer de pênis (CaPe) é considerado uma neoplasia rara em países desenvolvidos. No entanto, possui alta incidência em países em desenvolvimento, como os da África, Ásia e América do Sul. Dentre estes, o Brasil possui um dos maiores índices registrados da doença, sendo o estado do Maranhão um dos que apresenta maior incidência da doença. Alguns fatores de risco têm sido relacionados com o desenvolvimento de CaPe, tais como idade, fimose, má higiene, tabagismo, etilismo, condições de inflamação crônica, infecção pelo papilomavírus-humano (HPV) e número de parceiros sexuais. No entanto, ainda são escassos os trabalhos sobre a biologia do tumor, sobretudo no que diz respeito a sua base genética. Diante da importância das alterações genéticas no estabelecimento e progressão tumoral, neste trabalho foi feita uma análise genômica global de tumores penianos de pacientes do estado do Maranhão. Além disso, foi investigada a presença de HPV e identificados os subtipos virais presentes nos tumores. Para isso, foram coletadas amostras de tecido tumoral fresco de 20 pacientes, cujos dados clínicos, histopatológicos e o perfil sócio-econômico foram disponibilizados. As amostras tumorais foram submetidas a extração de DNA pelo método de fenol/clorofórmio. A detecção e genotipagem de HPV foi feita por PCR (Polymerase Chain Reaction) tipo nested para 40 subtipos virais. O perfil genômico dos tumores foi analisado pela técnica de array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) utilizando a plataforma SurePrint G3 Human CGH Microarray Cancer 4x44K (Agilent Technologies Inc, Ca). A análise dos resultados foi feita no software Cytogenomics v.4.0 (Agilent Technologies Inc, CA). Os parâmetros clínicos e histopatológicos foram avaliados em relação aos dados genéticos pelo teste exato de Fisher e Teste T de Student. Nossos dados revelaram que 73,7% dos tumores apresentavam o genoma viral. Foram detectados os subtipos virais de baixo risco oncogênico (6, 30, 44 e 74) e alto risco (16, 18, 30, 35, 58, 59, 66 e 73), sendo que 57% dos tumores apresentaram o subtipo16. A análise genômica global revelou 50 regiões genômicas com alterações no número de cópias presentes em pelo menos 40% dos tumores. Prevaleceram ganhos em 1p, 1q, 3q, 7p, 7q, 8q, 9p, 10q, 11q, 14q, 15q, 16p, 18p, 20q, 22q e perdas em 1q, 4q, 8p, 10q, 15q e Yp. Em 100% das amostras foi detectada alteração em 14q32.33, com aumento de cópias dos genes KIAA0125, ADAM6, LIC00226, LINC00211, MIR7641-2. Quando correlacionadas com parâmetros clínico histopatológicos e infecção pelo HPV, 13 regiões cromossômicas alteradas associaram-se a variáveis como invasão perineural, estadiamento tumoral, grau histológico, tumor primário, tamanho do tumor e infecção pelo HPV (p<0.05). Essas alterações envolviam ganhos em 1q, 2p, 3q, 7p, 7q, 15q, 16p, 18p e 20q e perdas em 10q, destacando-se genes como RGS7, REG1A, NRXN1, GNAI1, HERC2, UBE3A, EPB41L3 e EDN3. O perfil genômico detectado nesse estudo sugere o envolvimento de alterações em diversos genes na carcinogênese peniana, sendo necessária validação desses marcadores por análises gênica e funcional específicas que determinem quais dessas alterações participam efetivamente da tumorigênese peniana, a fim de que potenciais alvos moleculares possam ser utilizados, futuramente, como ferramenta diagnóstica, prognóstica e terapêutica no câncer peniano.__ABSTRACT Penile cancer is considered a rare neoplasm in developed countries. However, its incidence is high in developing ones, as in Africa, Asia and South America. Brazil has one of the highest index registered of the disease, with Maranhão being the highest of the states. Some risk factors have been related to the development of penile cancer (PeCa), such as age, phimosis, inadequate hygiene, smoking, alcohol consumption, chronic inflammation, human papillomavirus (HPV) infection, and number of sexual partners. Notwithstanding, research regarding the biology of PeCa is rare, specially its genetics base. Considering the importance of mutations in the tumour establishment and progression, this research performed a global genomic analysis of penile tumours in patients in the state of Maranhão. Furthermore, the presence of HPV was investigated and viral subtypes identified. Fresh tumour samples were collected from 20 patients, whose clinic histopathological and socioeconomic profile data were available. DNA extraction from tumour samples were performed using phenol/chloroform method. HPV detection and genotyping was carried out through nested PCR (Polymerase Chain Reaction) for the 40 viral subtypes. Tumour genomic profile was analyzed through array-CGH technique (Comparative Genomic Hybridization) using SurePrint G3 Human CGH Microarray Cancer 4x44K platform (Agilent Technologies Inc, Ca). Result analyzes were carried out using Cytogenomics v.4.0 software (Agilent Technologies Inc, CA). Clinical and histopathological parameters were evaluated by Fisher's exact test. Thereby, our data showed that 73.7% of the tumors presented the viral genome. Viral subtypes of low oncogenic risk (6, 30, 44 and 74) and high risk (16, 18, 30, 35, 58, 59, 66 and 73) were detected with 57% of tumors presenting the subtype16. Genomic analyzes reveled 50 genomic regions with copy number alterations in at least 40% of the tumours. Most of the alterations are regarding gains in 1p, 1q, 3q, 7p, 7q, 8q, 9p, 10q, 11q, 14q, 15q, 16p, 18p, 20q, 22q and losses in 1q, 4q, 8p, 10q, 15q and Yp. In 100% of the samples was detected alteration in 14q32.33, with increased copy number of KIAA0125, ADAM6, LIC00226, LINC00211, MIR7641-2 genes. Correlating clinical-histopathological parameters and HPV infection, 13 modified chromosomal regions were associated to variables such as perineural invasion, tumour staging, histological grade, primary tumour, tumour size and HPV infection (p<0.05). These alterations represent gains in 1q, 2p, 3q, 7p, 7q, 15q, 16p, 18p and 20q and losses in 10q, highlighting genes as RGS7, REG1A, NRXN1, GNAI1, HERC2, UBE3A, EPB41L3 and EDN3. The genomic profile detected in this research indicates that alterations in several genes are involved in penile carcinogenesis, being necessary to validate these markers by specific genetic and functional analyzes to identify which of these play a role in penile tumorigenesis. Thereby, potential molecular targets could be used in the future as diagnostic, prognostic and therapeutic tools in penile cancer.